本发明公开了一种大豆抗倒伏主效基因位点及应用。该大豆抗倒伏主效基因位点及其在分子标记辅助选择育种中的应用。该抗倒伏主效基因位点为qLD.13-1，贡献率为37.6%。与抗倒伏主效基因位点紧密连锁的分子标记为GmSSR13-27。利用紧密连锁的分子标记检测育种群体家系是否含有该主效基因位点，可预测其抗倒伏性，大大提高了大豆抗倒伏育种的选择效率。
1.鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆、中豆29和中豆32的基因组DNA为模板，用由SEQxa0IDxa0No.1和SEQxa0IDxa0No.2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴定大豆的抗倒伏性状：如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆29的PCR扩增产物大小相同的条带，所述待鉴定大豆为抗倒伏大豆或为候选抗倒伏大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆32的PCR扩增产物大小相同的条带，所述待鉴定大豆为非抗倒伏大豆或为候选非抗倒伏大豆；所述待鉴定大豆选自中豆29×中豆32的杂种后代中的F7及其以后世代的家系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为60g/L，所述聚丙烯酰胺凝胶的交联度为5%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中先进行10个第一个循环后再进行25个第二个循环，所述第一个循环的引物退火条件为60℃30s，所述第二个循环的引物退火条件为55℃30s。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第一个循环的温度程序是：先94℃30s，然后60℃30s，最后72℃1min；所述第二个循环的温度程序是：先94℃30s，然后55℃30s，最后72℃1min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待鉴定大豆选自中豆29×中豆32的杂种后代中的F7至F11家系。
6.权利要求1-5中任一所述的方法的用途，所述用途为1）、2）或3）：1）权利要求1-5中任一所述的方法在大豆育种中的应用；2）权利要求1-5中任一所述的方法在大豆抗倒伏性状的早期预测中的应用；3）权利要求1-5中任一所述的方法在筛选抗倒伏大豆中的应用。
7.鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的引物对，名称为GmSSR13-27，由SEQxa0IDNo.1和SEQxa0IDxa0No.2所示的两条单链DNA组成。
8.含有权利要求7所述的引物对的鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的试剂或试剂盒。
9.权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒的用途，所述用途为a）、b）或c）：a）权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒在大豆育种中的应用；b）权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒在大豆抗倒伏性状的早期预测中的应用；c）权利要求7所述的引物对、权利要求8所述的试剂或试剂盒在筛选抗倒伏大豆中的应用。技术领域
本发明属于大豆分子生物学及遗传育种技术领域。更具体涉及一种大豆抗倒伏主效基因位点及与该主效基因位点紧密连锁的分子标记，同时还涉及该分子标记在大豆抗倒伏育种中的应用。
背景技术
大豆是一种重要农作物，在我国国民经济发展以及世界粮食作物构成和国际油料作物生产中均占有重要地位。植株倒伏是大豆生产中一个普遍存在的严重问题，已成为实现大豆高产稳产和优质的主要限制因素之一，特别是生育后期遭受风雨影响，极易造成倒伏。倒伏破坏作物群体结构，打乱叶片在空间的正常分布秩序，降低光合效率；倒伏植株易受污染并加剧病虫危害，增加农药使用量；生长后期倒伏不仅会增加收获难度，不适应机械化收获，极大地影响收获产量，而且会引起籽粒皱缩，降低含油量等，使大豆外观品质和内在品质都受到严重影响。一般大豆倒伏可引起减产20%左右，严重倒伏造成的大豆减产率在45%－80%之间。有些高产品种由于不抗倒伏，遇到风雨灾害易造成严重产量损失，因而很难推广应用。为了防治大豆倒伏，生产上采用一些防控栽培措施，包括使用植物生长调节剂，如三碘苯甲或多效唑等，虽然有较好的防倒效果，但增加了生产成本，并对生态环境会造成一定的影响，不利于生态农业的发展。通过矮秆育种可以提高作物的抗倒能力，但矮秆品种的生物产量明显低于高秆品种，矮秆品种只有通过提高经济系数来提高经济产量，而经济系数的提高有一定的限度，如果只靠降低株高来增加抗倒能力，势必会降低生物产量，进而影响经济产量的提高。随植株矮化，出现叶层密集、群体内通风透光不畅、植株早衰、病虫害加重、籽粒皱瘪等一系列不良反应。目前水稻超高产育种发展趋势是：适当提高株高，以增加生物学产量而提高谷物产量。有关大豆的研究也表明，大豆株高与倒伏程度呈极显著正相关，株高也与单株产量及有关产量构成因子呈极显著正相关，表明株高既影响植株倒伏也影响籽粒产量，使得高产与倒伏矛盾突出。因此，提高大豆的抗倒性，是实现大豆高产稳产的有效途径。作物的许多重要农艺性状如产量、品质和抗性等都是数量性状，由多个基因控制，表现为连续变异，且易受环境影响，相对于由单基因控制的质量性状而言，选择效果不好。通过构建遗传图谱，定位数量性状位点（quantitativexa0traitxa0loci，QTL），利用与QTL紧密连锁的分子标记在早代对育种材料进行选择，可克服环境影响，节约生产成本，提高选择效率，加快育进程。对大豆抗倒伏的QTL定位研究也有一些报道，但检测出的QTL效应值较小，且重复性不好，较难在大豆育种中应用。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的方法，包括如下步骤：分别以待鉴定大豆、中豆29和中豆32的基因组DNA为模板，用由SEQxa0IDxa0No.1和SEQxa0IDxa0No.2所示的两条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所得到的PCR产物，按照下述方法确定所述待鉴定大豆的抗倒伏性状：如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆29的PCR扩增产物大小相同的一个条带，所述待鉴定大豆为抗倒伏大豆或为候选抗倒伏大豆，如果待鉴定大豆的PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示为与中豆32的PCR扩增产物大小相同的一个条带，所述待鉴定大豆为非抗倒伏大豆或为候选非抗倒伏大豆；所述待鉴定大豆选自中豆29×中豆32的杂种后代中的F₇及其以后世代的家系。其中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度（凝胶溶液中单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺的总质量浓度）可为60g/L，所述聚丙烯酰胺凝胶的交联度（凝胶溶液中甲叉双丙烯酰胺占丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量分数）可为5%。上述方法中，所述PCR扩增中先进行10个第一个循环后再进行25个第二个循环，所述第一个循环的引物退火条件为60℃30s，所述第二个循环的引物退火条件为55℃30s。其中，所述第一个循环的温度程序是：先94℃30s，然后60℃30s，最后72℃1min；所述第二个循环的温度程序是：先94℃30s，然后55℃30s，最后72℃1min。上述方法中，所述待鉴定大豆具体选自中豆29×中豆32的杂种后代中的F₇至F₁₁家系。在本发明的一个实施例中，所述待鉴定大豆具体选自中豆29×中豆32的杂种后代中的F₁₁的家系。上述方法中，所述抗倒伏大豆是指倒伏率≤25%的大豆品种或品系，如倒伏率低于21%的大豆品种或品系；所述非抗倒伏大豆是指倒伏率＞25%的大豆品种或品系。上述方法中，在中豆29×中豆32这个杂交组合中，中豆29为母本，中豆32为父本。上述方法可用于大豆育种、大豆抗倒伏性状的早期预测和筛选抗倒伏大豆。在大豆育种中，可选择上述方法鉴定出的抗倒伏大豆或候选抗倒伏大豆进行育种。本发明所要解决的另一个技术问题是提供鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的引物对。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的引物对，名称为GmSSR13-27，由SEQxa0IDxa0No.1和SEQxa0IDxa0No.2所示的两条单链DNA组成。其中，SEQxa0IDxa0No.1由22个脱氧核苷酸组成，SEQxa0IDxa0No.2由24个脱氧核苷酸组成。含有上述引物对GmSSR13-27的鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。上述引物对GmSSR13-27、含有上述引物对GmSSR13-27的试剂或试剂盒的下述a）、b）或c）用途也属于本发明的保护范围：a）在大豆育种中的应用；b）在大豆抗倒伏的早期预测中的应用；c）在筛选抗倒伏大豆中的应用。本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种大豆抗倒伏主效基因位点。本发明所提供的大豆抗倒伏主效基因位点是qLD.13-1，该主效基因位点的贡献率（37.6%）超过已往的报导，对大豆抗倒伏起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择。本发明的引物对GmSSR13-27，是与主效基因位点qLD.13-1紧密连锁的标记，与主效基因位点qLD.13-1相距0.8cM，且是基于PCR技术的共显性SSR标记，因而可靠且使用方便。实验证明，利用引物对GmSSR13-27对大豆育种群体进行辅助选择得到了倒伏率低于21%的抗倒伏家系，这表明引物对GmSSR13-27用于大豆抗倒伏育种的分子标记辅助选择是切实有效的。本发明通过对大豆抗倒伏的QTL定位，首次精细定位了抗倒伏主效基因位点qLD.13-1并获得了与其紧密连锁的分子标记GmSSR13-27，该大豆抗倒伏主效基因位点qLD.13-1，可解释37.6%的表型变异，可用于图位克隆和分子标记辅助选择。在常规育种方法中，抗倒伏性状要等到成熟期才能鉴定，且易受环境，尤其是风雨的影响，鉴定田间误差大，选择效率低下。通过检测抗倒伏主效基因位点来预测大豆抗倒伏性状，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，从而加快育种进程。本发明中抗倒伏主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与抗倒伏主效基因位点紧密连锁的分子标记，即可预测抗倒性，进而准确快速筛选高抗倒伏的材料。本发明通过分子标记GmSSR13-27辅助选择得到的家系倒伏率均低于21%，利用本发明的GmSSR13-27进行分子标记辅助选择可提高大豆抗倒伏育种的选择效率，加快育种进程。
附图说明
图1为利用GmSSR13-27对1-36的家系的F₁₁代、母本和父本的基因组DNA进行PCR得到的PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中1-36为材料编号，Pl和P2分别代表母本中豆29和父本中豆32。图2为大豆抗倒伏性状LOD值分布曲线。图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表LOD值。箭头所示为抗倒伏主效基因位点(qLD.13-1)曲线。图3为大豆13号染色体对应的F连锁群。左侧为抗倒伏主效基因位点(qLD.13-1)位置及置信区间示意图，右侧为标记名称及遗传距离（cM）。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。大豆中豆29和中豆32（周新安等，大豆重组自交系群体三、四粒荚变异及其与产量的关系，中国油料作物学报，2005，27：22-25）公众可从商业途径获得，也可从中国农业科学院油料作物研究所获得，以重复本发明实验。在以下的实施方案中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京:科学出版社，2002)所提供的方法进行。实施例1、利用引物对GmSSR13-27鉴定中豆29×中豆32的F₁₁家系的抗倒伏性状一、鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的PCR试剂本实施例的鉴定或辅助鉴定大豆抗倒伏性状的PCR试剂由PCR引物对GmSSR13-27、10×Taq缓冲液，dNTP混合物，MgC1₂溶液、Taqxa0DNA聚合酶和ddH₂O组成。其中，PCR引物对GmSSR13-27由正向引物和反向引物这两条单链DNA组成，其序列如下：正向引物:5’-TTTGTCGTATTTAGCTTCAGGC-3’（SEQxa0IDxa0No.1），反向引物:5’-TCCACTTCTTATTTCTTATTTGCG-3’（SEQxa0IDxa0No.2）。二、待鉴定大豆中豆29×中豆32的F₁₁家系是按照如下方法获得：中豆29和中豆32杂交，杂交后代连续自交，在F₃即分株行种植，以后各世代均从每一个株行中随机选择一个单株，衍生出下一世代。自F₇世代同一个家系内随机选择5个单株，种子混合，不同家系分别种植，获得由406个F₁₁株系组成的重组自交系群体。其中，从F₂至F₁₁的杂交方式均为自交。三、田间实验和利用引物对GmSSR13-27鉴定待鉴定大豆的抗倒伏性状（一）随机区组实验测定倒伏率从步骤二的406个家系中随机选36个F₁₁家系，即编号为1-36的大豆材料种植以测定每个家系的倒伏率。试验采用随机区组设计，共设三个重复区。每个重复区设38个小区，36个家系中每个家系1个小区，母本中豆29（P1）1个小区，父本中豆32（P2）1个小区，所有试验材料种植于中国农业科学院油料作物研究所试验农场。每个小区种植3行，行长3.5m，行距为0.4m，株距为0.1m。大豆成熟时，参照邱丽娟等（邱丽娟等.大豆种质资源描述规范和数据标准,中国农业出版社,2006）方法测定抗倒伏率：在大豆成熟时，以试验小区全部植株为观察对象，计算倒伏（主茎与地面倾斜角度小于30°）植株占全小区植株的比率。倒伏率≤25%为抗倒伏大豆，倒伏率＞25%为非抗倒伏大豆。结果如表2所示，表明家系1、2、4、6、7、10、12、14、16、17、18、23、24、27、28、32、34、35这18个家系以及中豆29的倒伏率均低于21%，是抗倒伏大豆；家系3、5、8、9、11、13、15、19、20、21、22、25、26、29、30、31、33、36这18个家系以及中豆32的倒伏率均高于39%，是非抗倒伏大豆。（二）利用引物对GmSSR13-27鉴定大豆的抗倒伏性状在步骤（一）编号为1-36的家系的F₁₁代、母本中豆29（P1）和父本中豆32的3叶期分别采集大豆叶片提取其基因组DNA，利用引物对GmSSR13-27进行PCR扩增，对得到的PCR扩增产物进行60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶（交联度为5%）电泳，检测电泳条带大小。其中，编号为1-36的家系每个家系采集5个植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA，母本采集10个植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA，父本采集10个植株的叶片等质量混合后提取基因组DNA。具体的实验方法如下：1、用CTAB法(Keimxa0P.Axa0rapidxa0protocolxa0forxa0isolatingxa0soybeanxa0DNA.Soybeanxa0genetxa0newslett,1988,15:147-148)提取叶片基因组DNA（1）取0.5g新鲜叶片放入1.5m1离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入700μl经65℃预热30min的CTAB溶液和20μlβ-巯基乙醇摇匀，放入65℃的水浴锅中水浴30min。（2）取出离心管，加入700μl氯仿-异戊醇（24：1/v：v）轻摇几次，静置30min后12000rpm，离心10min。（3）吸取上清液，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，置于-20℃冰箱30min。12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液。（4）用75%(V/V)乙醇清洗2-3次，倒乙醇溶液，打开离心管盖置于通风橱内吹干。（5）加入200μl双蒸水溶解DNA，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。2、分别以步骤1提取的中豆29×中豆32的的F₁₁代家系1-36及亲本的基因组DNA为模板，利用引物对GmSSR13-27进行PCR扩增，反应体系如表1:表1.成份
体积
DNA模板（25ng/μl）
2μl
正向引物（50ng/μl）
1μl
反向引物（50ng/μl）
1μl
10×Taq缓冲液
1μl
MgC1₂(25mM)
1μl
dNTPs混合物(10mM)
0.2μl
Taqxa0DNA聚合酶(5U/μl)
0.1μl
ddH₂0
3.7μl
总体积
10μl
PCR反应温度程序:先94℃5min（预变性）；然后进行10个如下循环：先94℃30s（变性），然后60℃30s（引物退火），最后72℃1min（引物延伸）；然后进行25个如下循环：先94℃30s（变性），然后55℃30s（引物退火），最后72℃1min（引物延伸）；最后72℃5min。PCR反应完成后，在扩增产物中加入等体积的上样缓冲液进行下述步骤3的60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制:试剂1：5×TBETris-basexa0xa0xa0xa0xa0xa0xa053.9克EDTAxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa03.72克硼酸xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa027.5克用超纯水定容至1升。试剂2：60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="610"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="661"/>用超纯水定容至1升。试剂3：粘剂无水乙醇xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0500毫升冰醋酸xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa05毫升反硅化剂(Me-T)xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa05毫升试剂4：不粘剂无水乙醇xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0500毫升硅化剂xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa014毫升试剂5：50×上样缓冲液甲酰胺xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0200毫升二甲苯青xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa02.5克溴酚蓝xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa02.5克试剂6：固定液冰醋酸xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0150毫升纯水xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01.35升试剂7：染色液硝酸银xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01.5克甲醛xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa02.0毫升用纯水定容至1.5升。试剂8：显影液碳酸钠xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa045克硫代硫酸钠(lOmg/ml)xa0xa0xa0200微升甲醛(37%)xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa02.0毫升用纯水定容至1.5升。胶板制备：短胶板在下，放置胶条，再放上长胶板。然后用夹子对称地夹好两块胶板。取70ml的60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶，加入200μl过硫酸铵和40μlxa0TEMED迅速搅拌混匀。缓慢把胶液灌入胶板中，待胶液灌满整个胶板时，将齿状梳子平端插入胶板中适当距离。电泳：待胶液凝固后，将齿状梳子取出，用自来水冲洗凝胶顶部。然后将胶板置入电泳槽中，并在上下槽中注入适量的1×TBE电泳缓冲液。打开电源，2000伏特预热20分钟。在PCR产物中加入上样缓冲液10μl，在95℃下加热变性5分钟，然后迅速置于冰上。用吸管吹打凝胶顶部以吹出杂物。将梳子齿端插入凝胶适当位置。吸取样品2.5μl，依次加入加样孔。2000伏特，80瓦，电泳70-80min。电泳完毕后，切开电源，把胶板从电泳槽中取出。染色:浆胶板面向上放入固定液盆中固定30分钟左右至胶板无色，在蒸馏水盆中漂洗两次，每次2-3分钟。取出胶板面向上放入染色液盆中染色30分钟。取出胶板，在蒸馏水盆中漂洗10秒左右。取出胶板面向上放入预冷(4℃)的显影液中，轻轻摇动至条带清晰可见。取出胶板面向上放入固定液盆中，以终止显影。在蒸馏水盆中漂洗3分钟，室温下自然凉干，拍照保存。5、带型判读将显影后自然干燥好的玻璃板置于灯箱上，肉眼观察各个家系与两亲本条带的位置差异。结果表明，中豆29的PCR产物是一个条带，命名为条带A；中豆32的PCR产物是一个条带，命名为条带B；条带A的大小明显大于条带B。各个家系带型与中豆29相同读作A，带型与中豆32相同读作B，两条带型分别与中豆29和中豆32相同读作H，缺失和其它带型读作－。结果如图1所示，表明家系1、2、4、6、7、10、12、14、16、17、18、23、24、27、28、32、34、35这18个家系与中豆29带型相同，PCR产物均是大小相同的条带A。家系3、5、8、9、11、13、15、19、20、21、22、25、26、29、30、31、33、36这18个家系与中豆32带型相同，PCR产物均是大小相同的条带B。根据PCR扩增产物凝胶电泳条带与母本中豆29、父本中豆32的异同鉴定或预测F₁₁代家系1-36的抗倒伏性状：如果PCR扩增产物凝胶电泳条带与中豆29相同，则待鉴定大豆为抗倒伏大豆或为候选抗倒伏大豆，如果PCR扩增产物凝胶电泳条带与中豆32相同，则待鉴定大豆为非抗倒伏大豆或为候选非抗倒伏大豆。本发明利用引物对GmSSR13-27鉴定大豆抗倒伏性状的方法鉴定的结果是家系1、2、4、6、7、10、12、14、16、17、18、23、24、27、28、32、34、35这18个家系以及中豆29均为抗倒伏大豆或均为候选抗倒伏大豆，家系3、5、8、9、11、13、15、19、20、21、22、25、26、29、30、31、33、36这18个家系以及中豆32均为非抗倒伏大豆或均为候选非抗倒伏大豆。标记GmSSR13-27鉴定结果与田间倒伏性状的鉴定结果一致。表2.母本中豆29、父本中豆32及中豆29×中豆32的F₁₁代家系1-36的倒伏率及利用引物对GmSSR13-27得到的PCR产物带型家系编号
带型
倒伏率(%)
家系编号
带型
倒伏率(%)
1
A
4.88
19
B
49.01
2
A
14.67
20
B
89.21
3
B
81.15
21
B
85.83
4
A
13.23
22
B
61.71
5
B
57.08
23
A
2.59
6
A
12.43
24
A
14.66
7
A
16.68
25
B
39.83
8
B
67.23
26
B
57.85
9
B
46.82
27
A
18.11
10
A
17.05
28
A
5.50
11
B
71.45
29
B
75.18
12
A
20.66
30
B
52.58
13
B
50.34
31
B
54.26
14
A
7.21
32
A
15.33
15
B
67.83
33
B
42.19
16
A
13.45
34
A
10.57
17
A
7.76
35
A
9.85
18
A
12.57
36
B
88.97
中豆29
A
17.8
中豆32
B
62.5
表2中，带型A表示引物对GmSSR13-27PCR扩增产物凝胶电泳条带与中豆29相同，带型B表示引物对GmSSR13-27PCR扩增产物凝胶电泳条带与中豆32相同。以上实验结果说明利用引物对GmSSR13-27鉴定大豆抗倒伏性状的方法与田间试验方法的结果一致，说明本发明利用引物对GmSSR13-27鉴定大豆抗倒伏性状的方法准确性高。实施例2、本发明的大豆抗倒伏主效基因位点及引物对GmSSR13-27的获得使用的分离群体为倒伏差异极显著的大豆品种中豆29（17.8%）和中豆32（62.5%）杂交，衍生出的包含406个家系的大豆重组自交系群体（周新安等，大豆重组自交系群体三、四粒荚变异及其与产量的关系，中国油料作物学报，2005，27：22-25）。该分离群体的构建方法同上述步骤二。从重组自交系群体中随机抽取165个家系进行分子标记分析（周蓉等,大豆幼苗根系性状的QTL分析，作物学报,2011,37:1151-1158），获得基因型数据，利用Joinmap3.0构建遗传图谱，结合倒伏率数据，利用WinQTLxa0cartographer2.5进行QTL定位，在大豆13号染色体上定位到大豆抗倒伏主效基因位点qLD.13-1,贡献率为37.6%，属于完全显性遗传。其中，DNA提取、PCR扩增、电泳同上述实施例1。SSR分析：引物序列参照Song等（2004）公布的大豆SSR引物。同时根据大豆基因组序列，利用SSRHunter软件搜索SSR（搜索条件为2-5个motif且重复数在5个以上），再根据Primer5软件设计SSR引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。其中，抗倒伏主效基因位点qLD.13-1紧密连锁的分子标记为申请人自主开发的SSR标记GmSSR13-27，引物序列为:GmSSR13-27-F：5’-TTTGTCGTATTTAGCTTCAGGC-3’（SEQxa0IDxa0No.1），GmSSR13-27-R：5’-TCCACTTCTTATTTCTTATTTGCG-3’（SEQxa0IDxa0No.2）。遗传连锁图谱构建和QTL定位:运用Joinmap3.0软件进行连锁图谱的构建。以LOD>3.0进行标记间连锁分组。Joinmap参数设置为:Rec=0.40,LOD=2.0,Jump=5,用以决定多态性标记在连锁群中的顺序。采用Kosambi函数将重组率转换成图距单位(cM)。利用Windowsxa0QTLxa0Cartographerxa0Version2.5软件对数据进行分析，采用复合区间作图法（CIM）进行QTL定位。以排列测验法确定每个性状LOD值的阈值，重复抽样1000次，显著水平定为0.01。在大豆13号染色体上定位到大豆抗倒伏主效基因位点qLD.13-1,贡献率为37.6%（表3，图2，图3）。表3.大豆抗倒伏主效基因位点位点
位置（cM）
贡献率（%）
LOD值
置信区间（cM）
加性效应
qLD.13-1
49.5
37.6
15.9
46.7-50.1
9.48
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